Biochemiluminescencja układów porfirynówych z nadtlenkiem wodoru
Ładowanie...
Data
1970
Tytuł czasopisma
ISSN czasopisma
Tytuł tomu
Wydawca
Wyższa Szkoła Rolnicza w Szczecinie
Abstrakt
In the present work, the current state of investigations concerning the ultra-weak chemiluminescence (CL) of animal organs, tissues, and their homogenates is discussed. This chemiluminescence is related to the non-enzymatic oxidation of biolipids; however, it may also be associated with other substrates and reactions. The authors have considered the reactions of porphyrin complexes with hydrogen peroxide as a possible source of generation of excited, light-emitting species. Currently, there is a lack of investigations addressing the CL of porphyrin complexes with H₂O₂ under uniform experimental conditions. Moreover, results from many studies are contradictory, referring exclusively to particular compounds such as catalase, peroxidase, chlorophyll, etc. The purpose of this work is to investigate the CL of different porphyrin complexes with H₂O₂ in simple systems under approximately physiological conditions. Aqueous solutions of porphyrin were injected into the H₂O₂ + NaHCO₃ - Na₂CO₃ buffer solution at pH 8.8. The solutions were vigorously mixed by a stream of O₂. Concentrations of reagents in the reaction mixture (in moles/l) were: 1 × 10⁻⁵ porphyrin or enzyme, 1 × 10⁻² buffer; temperature 303 K. Luminescence was recorded during the injection of particular components using a photoelectric system with an RCA 6655 photomultiplier. The CL kinetics of Fe³⁺, hemin, chlorophyll a, catalase, peroxidase, cytochrome c, and hemoglobin with H₂O₂, as well as the influence of respiratory and free radical inhibitors on the light reaction, were studied. Additionally, the effects of temperature, pH, and ultraviolet irradiation on fresh blood and hemoglobin solution were tested. It was found that the CL kinetics consists of two steps: (1) a high peak with a duration of 10–15 seconds, and (2) a long-lived but low-intensity luminescence. Both steps follow first-order kinetics with rate constants k₁ = 0.18–0.03 s⁻¹ and k₂ = (2.8–3.6) × 10⁻² s⁻¹, respectively. Respiratory inhibitors such as KCN, NaN₃, NaF, as well as thermal and hydrolytic inactivation of Fe-porphyrin-proteides, strongly affect the maximal intensity (Iₘₐₓ) and total light output (J) of CL. Free radical inhibitors such as ascorbic acid, α-naphthol, and hydroquinone quench 80–100% of Iₘₐₓ and J of CL. An increase in pH and temperature results in elevation of Iₘₐₓ and J. The temperature coefficient for CL of the hemoglobin-H₂O₂-buffer system is 1.55 ± 0.3, and the activation energy is 22.76 ± 2.15 kJ/mole in the range of 298–313 K. The solution of fresh blood and hemoglobin irradiated with UV (350 W, 2–15 minutes) exhibits CL similar to that with H₂O₂ buffer but with 10–15 times lower intensity. Data indicate that an important role in generating the excited, light-emitting species is played by the nucleophilic reaction of the ·OOH radical ion with the carbon atom in the methine bridge, which possesses the smallest electron density (q = 0.954), and, on the other hand, the presence of coordinatively bound Fe in the porphyrin ring.
В работе обсуждается современное состояние исследований сверхслабой хемилюминесценции (ХЛ) животных органов, тканей и их гомогенатов. Основной вклад в ХЛ вносит неферментативное окисление биолипидов, однако роль других субстратов и реакций не исключена. Авторы обращают внимание на возможность участия в сверхслабой ХЛ реакций порфириновых комплексов с перекисью водорода. До настоящего времени не проведено сравнительных исследований ХЛ различных порфириновых комплексов с H₂O₂ в идентичных условиях. Кроме того, результаты многих исследований противоречивы и касаются отдельных порфириновых комплексов, например, каталазы, пероксидазы, хлорофилла и др. Цель настоящей работы — изучение ХЛ различных порфириновых комплексов с перекисью водорода в простых системах и идентичных условиях, близких к физиологическим. Водные растворы порфириновых комплексов вводили с помощью шприца в раствор H₂O₂ + NaHCO₃ - Na₂CO₃ буфера при pH 8,8. Растворы промешивали струей кислорода (O₂). Концентрации реагентов в реакционной смеси (в молях на литр) составляли: 1×10⁻⁵ порфирин или фермент, 1×10⁻² H₂O₂, 2×10⁻² буфер, температура 303 K. Люминесценцию измеряли во время добавления отдельных реагентов с помощью фотоэлектрической установки с фотоумножителем RCA 6655. Изучена кинетика ХЛ в реакциях Fe³⁺, гемина, хлорофилла а, каталазы, пероксидазы, цитохрома с и гемоглобина с H₂O₂, а также влияние ингибиторов дыхания и свободнорадикальных реакций на хемилюминесценцию. Дополнительно исследовалось влияние pH, температуры и УФ-облучения на растворы свежей крови и гемоглобина. Установлено, что кинетика затухания ХЛ состоит из двух компонентов: (1) относительно сильный всплеск длительностью 10–15 секунд и (2) медленно затухающий низкоинтенсивный световой поток. Оба компонента описываются уравнениями первого порядка с константами скорости k₁ = 0,18–0,03 с⁻¹ и k₂ = (2,8–3,6)×10⁻² с⁻¹. Ингибиторы дыхательной цепи, такие как KCN, NaN₃, NaF, а также термическая и гидролитическая инактивация ферментов, содержащих порфириновое кольцо, значительно влияют на максимальную интенсивность (Iₘₐₓ) и суммарное свечение ХЛ. Ингибиторы свободнорадикальных реакций — аскорбиновая кислота, α-нафтол, гидрохинон — тушат свечение на 80–100% относительно Iₘₐₓ и интегрального сигнала ХЛ без ингибиторов. Повышение pH и температуры приводит к увеличению Iₘₐₓ и суммарного свечения. Температурный коэффициент ХЛ системы гемоглобин–H₂O₂–буфер равен 1,55 ± 0,3, энергия активации — 22,76 ± 2,15 кДж/моль в температурном диапазоне 298–313 K. Раствор свежей крови и чистого гемоглобина после УФ-облучения (ртутная лампа 350 Вт, 2–15 мин) проявляет аналогичное ХЛ, но интенсивность его в 10–15 раз ниже, чем в присутствии H₂O₂. Полученные данные указывают, что основную роль в образовании возбужденных, испускающих свет молекул играет нуклеофильная реакция радикала OOH с атомом углерода в метиновом мостике, обладающем наименьшей плотностью электронного заряда (q = 0,954), а также присутствие координативно связанного атома железа в порфириновом кольце.
В работе обсуждается современное состояние исследований сверхслабой хемилюминесценции (ХЛ) животных органов, тканей и их гомогенатов. Основной вклад в ХЛ вносит неферментативное окисление биолипидов, однако роль других субстратов и реакций не исключена. Авторы обращают внимание на возможность участия в сверхслабой ХЛ реакций порфириновых комплексов с перекисью водорода. До настоящего времени не проведено сравнительных исследований ХЛ различных порфириновых комплексов с H₂O₂ в идентичных условиях. Кроме того, результаты многих исследований противоречивы и касаются отдельных порфириновых комплексов, например, каталазы, пероксидазы, хлорофилла и др. Цель настоящей работы — изучение ХЛ различных порфириновых комплексов с перекисью водорода в простых системах и идентичных условиях, близких к физиологическим. Водные растворы порфириновых комплексов вводили с помощью шприца в раствор H₂O₂ + NaHCO₃ - Na₂CO₃ буфера при pH 8,8. Растворы промешивали струей кислорода (O₂). Концентрации реагентов в реакционной смеси (в молях на литр) составляли: 1×10⁻⁵ порфирин или фермент, 1×10⁻² H₂O₂, 2×10⁻² буфер, температура 303 K. Люминесценцию измеряли во время добавления отдельных реагентов с помощью фотоэлектрической установки с фотоумножителем RCA 6655. Изучена кинетика ХЛ в реакциях Fe³⁺, гемина, хлорофилла а, каталазы, пероксидазы, цитохрома с и гемоглобина с H₂O₂, а также влияние ингибиторов дыхания и свободнорадикальных реакций на хемилюминесценцию. Дополнительно исследовалось влияние pH, температуры и УФ-облучения на растворы свежей крови и гемоглобина. Установлено, что кинетика затухания ХЛ состоит из двух компонентов: (1) относительно сильный всплеск длительностью 10–15 секунд и (2) медленно затухающий низкоинтенсивный световой поток. Оба компонента описываются уравнениями первого порядка с константами скорости k₁ = 0,18–0,03 с⁻¹ и k₂ = (2,8–3,6)×10⁻² с⁻¹. Ингибиторы дыхательной цепи, такие как KCN, NaN₃, NaF, а также термическая и гидролитическая инактивация ферментов, содержащих порфириновое кольцо, значительно влияют на максимальную интенсивность (Iₘₐₓ) и суммарное свечение ХЛ. Ингибиторы свободнорадикальных реакций — аскорбиновая кислота, α-нафтол, гидрохинон — тушат свечение на 80–100% относительно Iₘₐₓ и интегрального сигнала ХЛ без ингибиторов. Повышение pH и температуры приводит к увеличению Iₘₐₓ и суммарного свечения. Температурный коэффициент ХЛ системы гемоглобин–H₂O₂–буфер равен 1,55 ± 0,3, энергия активации — 22,76 ± 2,15 кДж/моль в температурном диапазоне 298–313 K. Раствор свежей крови и чистого гемоглобина после УФ-облучения (ртутная лампа 350 Вт, 2–15 мин) проявляет аналогичное ХЛ, но интенсивность его в 10–15 раз ниже, чем в присутствии H₂O₂. Полученные данные указывают, что основную роль в образовании возбужденных, испускающих свет молекул играет нуклеофильная реакция радикала OOH с атомом углерода в метиновом мостике, обладающем наименьшей плотностью электронного заряда (q = 0,954), а также присутствие координативно связанного атома железа в порфириновом кольце.
Opis
Opracowanie rekordu w ramach umowy BIBL/SP/0060/2024/02 ze środków budżetu państwa, przyznanych przez Ministra Nauki w ramach Programu Społeczna odpowiedzialność nauki II.
Słowa kluczowe
biochemiluminescencja, układy porfirynowe, układy porfirynowe, nadtlenek wodoru, doświadczenia z zakresu fotochemiluminescencji
Cytowanie
Kruk, I., Sławińska, D., Sławiński J. (1970). Biochemiluminescencja układów porfirynówych z nadtlenkiem wodoru. Zeszyty Naukowe / Wyższa Szkoła Rolnicza w Szczecinie, Nr 34. Rolnictwo nr 7, s. 239-257. https://hdl.handle.net/20.500.12539/2810